(Nature) Un principio fundamental de la biología estructural es que, una vez que los investigadores puedan observar directamente las macromoléculas con suficiente detalle, debería ser posible comprender cómo sus estructuras 3D confieren sus funciones biológicas. De hecho, muchos avances científicos se han basado en la observación directa del mundo que nos rodea con el mayor detalle posible, y se están dedicando cada vez más esfuerzos a visualizar las estructuras atómicas de los componentes biológicos que tienen un papel clave en las enfermedades humanas. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), la cristalografía de rayos X y la microscopía crioelectrónica (crio-EM) son las tres principales técnicas de biología estructural en uso.

De los tres, cryo-EM ha surgido como el método actual “ir a” para determinar las estructuras de complejos grandes y dinámicos que han resultado difíciles de obtener con los otros enfoques.

Escribiendo en Nature , Yip et al. ¹ y Nakane et al. ² informan de las imágenes más nítidas obtenidas hasta ahora mediante el uso de un método denominado crio-EM de partícula única, que permite determinar por primera vez la ubicación de átomos individuales en una proteína. Los avances reportados por otros grupos también han producido mejoras notables en la resolución de imágenes crio-EM ^3 , 4 . En última instancia, estos desarrollos ayudarán a los investigadores a comprender mejor, con una resolución sin precedentes, cómo funcionan las proteínas en la salud y la enfermedad, con el potencial de ayudar al diseño de mejores terapias.

Aunque la crio-EM es una técnica de décadas de antigüedad, ha despertado un interés creciente desde alrededor de 2013 debido a una serie de avances tecnológicos y algorítmicos que, en conjunto, impulsaron una mejora notable en la resolución obtenible mediante esta técnica (descrita como la ‘revolución de la resolución’) ⁵ .

La recopilación de datos de crio-EM de una sola partícula comienza con una muestra de proteína que se ha aplicado a una rejilla de muestra especial. Sumergirlo en etano líquido congela rápidamente y atrapa las partículas de proteína en una fina película de hielo amorfo. Las imágenes bidimensionales de las partículas individuales en la cuadrícula de muestra, obtenidas mediante la aplicación de un haz de electrones, se promedian computacionalmente para producir una estructura 3D. Las imágenes 2D son increíblemente ‘ruidosas’ porque se debe utilizar una dosis baja de electrones para evitar dañar la muestra biológica sensible a la radiación. Como tal, estas imágenes históricamente no han sido adecuadas para determinar estructuras a un nivel atómico de detalle. Sin embargo, los avances reportados desde 2013 han permitido recopilar datos de crio-EM de partículas únicas que rivalizan con los obtenidos mediante cristalografía de rayos X.

La revolución de la resolución de cryo-EM ha seguido avanzando ⁶ . Yip y col. y Nakane et al. aprovechó las mejoras tecnológicas para determinar las estructuras de una proteína de almacenamiento de hierro estable llamada ferritina (denominada apoferritina en ausencia de metales) a una resolución de aproximadamente 1,2 ångströms. Estas estructuras son las reconstrucciones crio-EM de una sola partícula de mayor resolución determinadas hasta ahora, y los datos son de calidad suficientemente alta para resolver los átomos individuales en apoferritina (Fig. 1). Esta hazaña sin precedentes no se habría creído factible hace apenas una década.

El éxito de Yip y sus colegas se basó en los avances de hardware, incluidos componentes como un corrector de aberraciones esféricas más un dispositivo monocromador que aplica una serie de filtros para garantizar que solo los electrones con una estrecha dispersión de energías interactúen con la muestra, mejorando así la resolución de la imagen final. Nakane y sus colaboradores aplicaron una tecnología diferente, una pistola de emisión de campo frío que también genera electrones con una distribución de energía estrecha, junto con una tecnología que reduce el ruido en cada imagen al filtrar los electrones que interactúan de manera no productiva con la muestra. Además, Nakane et al. captura de datos con una cámara de detección de electrones altamente sensible de próxima generación.

Además de analizar la apoferritina, Nakane y sus colegas obtuvieron una estructura con una resolución de 1,7 Å de una forma del receptor para el ácido γ-aminobutírico tipo A (GABA _A ) que se diseñó para ser más estable que la forma común que se encuentra en los seres humanos. Este receptor es un complejo proteico que reside en la membrana celular de las neuronas y es un objetivo de numerosas terapias. La obtención de una resolución tan alta mediante crio-EM de una sola partícula se había considerado casi imposible para un espécimen biológico como este, que presenta un alto nivel de flexibilidad en términos de movilidad estructural en comparación con moléculas estructuralmente rígidas como la apoferritina. La estructura revela detalles del GABA _A receptor que nunca antes se había visto, lo que proporciona información, por ejemplo, sobre la unión de una molécula llamada histamina en el núcleo de la proteína.

Los desarrollos en hardware crio-EM descritos por Yip, Nakane y sus respectivos colegas han impulsado un avance importante en la resolución de crio-EM de una sola partícula. Cada equipo utilizó hardware que abordó distintos aspectos de las imágenes crio-EM que previamente habían limitado la resolución alcanzable. Con estas tecnologías, el aumento de la relación señal / ruido de las imágenes crio-EM ampliará la aplicabilidad de la técnica. Por ejemplo, esto podría incluir el uso de la técnica para determinar estructuras de alta resolución de muestras heterogéneas como las formadas por proteínas de membrana o complejos macromoleculares que varían en conformación o composición. Quizás la fusión de estas tecnologías permitirá la determinación de estructuras crio-EM con una resolución incluso superior a 1 Å. Esta vez podría haber parecido una búsqueda casi imposible de emprender.

Sin embargo, estas tecnologías representan el escalón de élite de la instrumentación crio-EM y actualmente están fuera del alcance de la mayoría de los institutos debido al costo de compra y operación. En el futuro, estos tipos de avances nos ayudarán a aprender más sobre lo que limita la resolución alcanzable y, por lo tanto, podría permitir el diseño de una mejor instrumentación. Aunque estas estructuras de alta resolución no son necesarias para responder a todas las preguntas biológicas, el detalle adicional que puede proporcionar dicho hardware limitaría las inexactitudes en las estructuras 3D y proporcionaría una mejor plataforma para comprender las funciones biológicas. No obstante, para la mayoría de las macromoléculas, la flexibilidad estructural inherente y la heterogeneidad estructural probablemente serán en cambio el factor limitante de resolución, independientemente de las capacidades de la instrumentación disponible. Para estos especímenes menos estables, la aplicación de nuevas tecnologías de preparación de muestras, junto con las mejoras en el rendimiento de la recopilación de datos y los avances en los algoritmos, ofrecerá nuevas formas de sondear los paisajes conformacionales de estos complejos. Por lo tanto, aunque la revolución de la resolución de cryo-EM podría estar llegando a su fin, en los próximos años esperan más revoluciones que harán que esta técnica sea aún más poderosa y aplicable a la investigación de diversas cuestiones biológicas.

doi: https://doi.org/10.1038/d41586-020-02924-y